顯微鏡動畫科普 眾里尋“它”千百度——寬場熒光顯微術

讓隱祕於黑暗中的特定目標自主發光 這正是熒光顯微鏡的核心思想 在複雜的生物樣本中實現對特定結構的精準標記與呈現 此前我們介紹的相差與DIC技術 雖能大幅提升透明標本的對比度 但它們並不具備特異性識別能力 而熒光顯微鏡藉助熒光標記 能將細胞核、內質網、細胞骨架等不同組分 熒光本質上是一種光致發光現象 當一個熒光分子中的電子處於穩定的基態時 若吸收一個高能量、短波長的光子 便會越遷至不穩定的激發態 在極短時間內 電子會以非輻射池域的方式耗散部分能量 隨後在回落至基態時 釋放一個能量更低、波長更長的光子 這個釋放出的光子就是熒光 其核心特徵在於 激發光與發射光之間存在波長差異 這一物理屬性 爲我們在光學上徹底分離它們提供了關鍵依據 這 是一臺搭載了寬敞熒光系統的顯微鏡 光源發出的複合光經熒光模塊過濾後 以特定波長的激發光照亮標本 標本中被標記的結構隨即受激 發出波長更長的熒光 兩束光各行其道 互不干擾 實現這一分離的核心 在於熒光濾塊模塊 它由激發濾光片、二相色鏡、發射濾光片組合而成 首先 激發濾光片從寬譜光源中篩選出特定短波長光 這道光到達二相色鏡 二相色鏡對短波長光高反 對長波長光高透 在此處它扮演着反射鏡的角色 將激發光高效地反射向下 經物鏡匯聚後照亮整個市場 樣品被激發後 發射出的長波長熒光與少量雜散激發光 一同被物鏡收集 當它們向上返回至二相色鏡時 由於波長更長 二相色鏡轉而變爲透光窗口 讓熒光順利通過 發射濾光片對通過的光進行最後一次甄別 徹底濾除殘留的激發光 確保了只有我們想要的熒光信號形成圖像 在活細胞成像等應用中 導致顯微鏡是主流選擇 它將光學系統巧妙置於樣品下方 當我們將培養敏置於在物臺上時 物鏡便能從底部向上觀察 這種設計天然適配培養敏等容器 爲長時間活細胞動態研究提供了極大的便利 針對樣本中不同的代測把標 我們可選用不同光譜特性的熒光模塊進行切換 以匹配對應染料的激發與發射波長 通過多通道採集與疊加 各壓細胞結構的空間定位 便被渲染成一幅信息豐富的絢麗彩圖 儘管寬敞熒光成像能力強大 但它存在一個固有侷限 層間干擾 由於激發光會均勻照亮整個市場內的所有縱深區域 導致膠屏面上方和下方的標記結構也同時被激發 所有深度的熒光信號 毫無保留地疊加到一幅圖像上 這不僅帶來了模糊的背景 更讓我們無法獲得清晰的光學切片 那麼能否只激發精確聚膠的那一薄層 從源頭消除離膠信號的干擾 這正是我們下一期將要深入解析的技術 激光掃描共聚膠顯微鏡