顯微鏡動畫科普 如何通過光的干涉，看清透明物體？相差顯微鏡工作機制解析

取一片乾淨玻璃對準窗外明亮的天空 它幾乎消失在環境光中 這是因為光透過鈣波片後強度衰減極微弱 無法與背景形成有效的明暗差異 這正是明場顯微鏡的核心困境 當觀察口腔上皮細胞等透明標本時 標本因過於透明而難以辨識 染色雖能增強對比度 卻會殺死活體樣本 如何在不改變標本狀態的條件下實現高對比度觀察 回到原先的情景中 儘管光在透過玻璃片後振幅幾乎無衰減 由於玻璃片與周圍空氣存在折射率差異 光透過玻璃片與透過等候的空氣層相比 所走的光程更長 此光程差會引發相位延遲 可惜人眼僅能感知光強度變化 無法直接識別相位信息 是否存在將相位差轉化為明暗差的顯微鏡技術 這就是本期解析的相差顯微鏡的核心突破 這 是一臺擁有相差功能的光學顯微鏡 它的核心結構是相差物鏡與帶環狀光纜的聚光鏡 相差物鏡的後焦面上有一塊相位板 相位板上有兩個光學塗層 一個是用來削弱背景光的減光塗層 另一個是用來產生四分之一波長相位延遲的塗層 光源發出的光經過聚光鏡前焦面上環狀光纜的過濾 大部分光從周圍穿過 未與標本發生相互作用 傳播方向不改變 並匯聚在物鏡後焦面上 我們稱它為環繞波 一小部分光被高折射率標本散射 衍射 產生的球面波被物鏡的全孔鏡收集 我們稱它為衍射波 衍射波由於穿過高折射率樣品 會產生額外的相位延遲 此時得到第一個相位差 明亮的背景光經過相位板上的減光塗層後強度衰減 得到了與衍射波正弧相近的環繞波 並且被相位延遲材料延遲四分之一波長 此時得到第二個相位差 由於兩束波初始相位相同 衍射波在標本處延遲了四分之一波長 環繞波在相位板上延遲了四分之一波長 兩束波的相位依舊相同 之後在中間橡皮面上干涉相長 得到正弧更大的波 最終成像圖就是樣本比背景更亮 這種相差屬於負相差 還有一種相差 它的相位板中的相位延遲材料 在環狀減光塗層以外的區域 這些相位延遲材料作用於衍射波 由於衍射波一開始就經過高折射樣本 相位被延遲四分之一波長 之後又在相位板上被延遲四分之一波長 此時衍射波與環繞波相位相差二分之一波長 兩種波振動方向相反 干涉相消 得到正弧更小的波 最終成像效果就是樣本比背景更黑 這種相差屬於正相差 常見的相差物鏡就是這種效果 由此可見 相差顯微鏡通過將相位差轉換為正弧差 從而大大提高對比度 那麼 它與同樣提升對比度的暗場顯微鏡有何本質區別? 以我們的血細胞為例 在暗場下 紅細胞僅呈現為明亮環狀輪廓 內部為均勻暗區 而相差成像能清晰呈現其雙凹圓盤形態 對於綠草蠕蟲等活體樣本 暗場雖可勾勒明亮外形 但其強烈散射眩光會掩蓋內部細胞器 相差成像則能抑制內部眩光 清晰展現細胞器形態及食物泡運輸等動態過程 因此 暗場顯微鏡擅長顯示樣本輪廓與位移 而相差顯微鏡的核心優勢 在於能呈現透明活體樣本的內部精細結構與物質分佈 為生命活動研究提供不可替代的觀測手段