人體免疫系統對於周邊神經損傷及疼痛的影響 (影片有中文字幕）

各位聽眾大家好，我是Paul。 我今天想分享我博士後階段所做的研究， 主題是人類免疫系統對周邊神經損傷及疼痛的影響 大家可以看到背景圖是一個非常漂亮， 我拍的，我用一個Spinning-disc confocal 一個共軛焦顯微鏡，它可以做活細胞攝影， 在這個microfluidic device微流道系統裡面，我可以養殖人類的感官神經 跟人類的免疫細胞做共培養， 也是接下來我主要分享的主題 介紹一下我自己， 我在神經科學領域有12年的研究經驗 從大學至研究助理階段， 我做很多神經退化性疾病的研究， 在博士期間我加入了一個實驗室 做關於自體免疫所導致的神經系統症候群， 主要是研究抗体跟免疫细胞如何破壞你的神經系统 在博士後階段，從去年1月開始， 我加入Oxford Neural Injury Group 我結合我以前神經科學的專長， 以及免疫學在博士期間學到的專長，去做Neuropathic Pain的研究 是一个慢性的神經疼痛， 然候，我的研究主題是關於神經跟免疫系統的交互作用 我們是一個大概有30個人的大組， 是由Professor David Bennett 跟下面的4個PI所lead的 有非常多的研究主题， 有從動物實驗到人類的組織，從 基因定序到RNA的Sequencing 從離子通道到抑制離子通道開合的一些藥物 去調控疼痛 也理解一些血液里面關於疼痛的一些biomarkers，還 有研究抗体所導致的周邊神經組織的壞死以及疼痛 物理治療對於疼痛的影響 也是我們琢磨的範疇 我們有跟其他的MRI實驗室 在牛津去合作 去一起研究疼痛 那我的小組 我在小組主要是做neuroimmune interaction 就是看說神經細胞當受損的時候 它要如何改變周邊免疫细胞的族群 免疫細胞又是如何修復受損的神經細胞 使它恢復到疼痛之前的表征 之所以神經免疫對於疼痛那麼重要 是因爲免疫細胞參與了疼痛的調節跟傳導 當你手受傷的時候 會有很多免疫細胞聚集在你的神經末端 分泌一些細胞因子啊 激素啊 導致神經變得很活躍 它就很容易感到不有自主的疼痛 就算不碰它也會痛 就是所謂的慢性紅腫熱痛那種感覺 然後在脊髓附近的話 免疫細胞也參與了這個疼痛訊號的傳導 使最後這個疼痛可以傳達到你的大腦 你就感觉到你的手在痛 00:02:47.748 --> 00:02:49.948 找出特定的免疫細胞 對疼痛的貢獻很重要 所以就可以做一個專一性的療法 去治療某一些疼痛的疾病 這是我跟我的同事去年在 在人類組織上所做的研究 目前是已經上載到MedRxiv 是一個preprint的階段 然後還在正刊審核 Morton’s Neuroma的中文叫做莫顿神經瘤 它是一種壓迫性的神經疼痛 當你做過多運動 喜歡穿跟鞋 然后走路走太多 或者是做一些需要久站的工作的話 你的第三第四指中間的神經 就會受到壓迫 壓迫之後就會纖維化 然後就會腫起來 我們就叫它神經瘤 那病人需要接受手術 所以手術之後我們就會有這個sample 一半我們就拿來做RNA定序 一半做組化螢光染色 然後在RNA定序方面 我們看到大概3000多個基因是 跟正常的神經是differential express 就是表達量是不一樣的 包含跟發炎，去髓鞘化以及纖維化相關的基因 包含跟T细胞與巨噬細胞相關的基因 在這個神經瘤里面也特别多 我們也找到一个特殊的巨噬細胞叫做 糖皮質素誘導的巨噬細胞 它帶有這三個膜上的 抗原markers 我們用這些markers定義說 我們找到了這種細胞在莫頓神經瘤裡面 那這種細胞為什麼很特别呢 因为它是屬於抗發炎性的 那在這個領域一般來說 大家會認為促發炎性的巨噬細胞pro-inflammatory 才會導致疼痛 對於抗發炎性的巨噬細胞了解是比較少的 但這種细胞它還會促進纖維化 所以有一說可能是它促進纖維化 導致神經更被壓迫進而導致疼痛 也是有可能的 這種免疫細胞在腫瘤跟在肺 尤其是氣喘病人身上的研究非常多 但是在疼痛的方面是還是很小眾的研究 所以我們覺得這是一個很好的切入點 就是做一些別人所不知道的東西 我們剛剛使用的是 莫頓神經瘤是病人的組織 那我們就是想說因為病人組織有時候比較難取得 我們就想要建立一個體外的一個 完全是人類的神經組織 以及人類的免疫細胞的共培養的系統 完全是從人過來的 這怎麼做呢 就是我們把人類的iPSC 就是誘導性全能幹細胞分化成感官神经 它就會長過去 然後這個microfluidic的微流道系統 它就可以把細胞核跟軸突分開 分開之後 你就可以模擬 就是人的感官神經的細胞核 是在脊髓附近 然後軸突是在肢體的末端 它們不是在一起的 就可以真正模擬在生理上所看到的樣貌 那在這方面我們可以做共培養 然後有個激光顯微鏡可以做切割 就可以損傷這個神經 那進而就可以模擬就是神經損傷的微環境 然後跟免疫細胞進行共培養 然後都是來自於人類的 這個很乾淨，就是兩邊分得很開 下一個問題是 我們要找一个所謂的 疼痛的indicator 或者是marker 因为我們不可能問這個细胞 說你疼痛了没 所以不可能给它一個調查問卷 所以你要有一個 生理上的一個marker去看 所以我們用的方法是偵測細胞的spontaneous activity 自主性的神經活化 它是你不用刺激神經,它就會自然的顫動 它的顫動的頻率大概是1赫茲 是不規律的在目前文獻有做說 偵測人類的 感官神經的細胞核 你就算不刺激它也會看到自主性的顫動 是1赫兹的 然後這個paper裡面 有一些病人是有周邊神經疼痛 也有看到疼痛的病人 有更高的percentage的神經是帶有這種pattern 那這種pattern它的 頻率大概是介於0到1赫兹 所以我們就可以把這個pattern spontaneous activity 跟疼痛做一個連接 然後進而去偵測它 我們使用的方法是用钙成像造影 钙成像的原理是 當神經激活的時候，膜上的的鈣離子通道會打開 打開之後鈣離子就會跑到神經裡面 然後跟裡面的indicator 我們所選用的是GCaMP 它就會跟鈣離子結合 那GCaMP跟鈣離子結合之後 它就會更容易被綠色螢光激活 激活之後就會更亮 就會像這樣 這種是Steady State 就是我不做任何情況 它是自主性的顫動 然後這個是在 我用KCl去depolarize (去極化) 就是激活所有神經 它也會看到瞬間變綠色 非常漂亮 然後我們使用的方法是 用腺病毒去把這個基因 遞載進去 轉染到這個細胞核 然後就會表現在所有的地方 包含細胞核以及所有的軸突 樹突上面 下一步我們是要去區分說 哪一些的細胞核 是有把這個軸突長過去的 所以我們在另外一邊是加入了一個 tdTomato的一個marker 就是它可以反向轉染到 這個軸突的部分 然後我們之所以用腺病毒9這個亞型是因為它可以反向轉 是因為它可以反向傳導 傳導過去的話 有把這個neurite這個軸突送過去的 的細胞核就會變紅色 沒有就是綠色 所以我們就可以分辨說 紅色是我們接下來要分析的部分 然後綠色不是 然後下一步呢 很有趣 是給大家放個影片 我們要區分什麼樣的信號是來自neuronal activity的 就是來自神經的什麼樣不是 因為不是所有的鈣離子的震盪都跟神經有關 所以我們使用了一個Lidocaine(利多卡因) Lidocaine(利多卡因)它是一個鈉離子通道抑制劑 它可以把所有的神經的活性降到最低 甚至是cancel掉 你可以看比較加之前 神經是很活躍的在跳動 我什麼都沒有做 它就自主性的做一些顫動 那加之後 它就很鎮定 所以你就可以知道說 在這張影像裡面你看到的 這張影像裡面你所看到的 是 去除掉所有的neural activity 之外的calcium fluctuation 你可以把它當成是一個 對照組,跟這個來比 你就可以把所謂的 background 去掉 所以在我們的 pipeline 裡面 第一我們是 圈出了紅色的細胞 它是 像我剛剛說的 它有把它的軸突送過去的 就是我們要分析的對象 然後我用 ImageJ 去把這個 裡面的綠色的 signal 萃取出來 然後去做圖，跟時間做圖 我們每一個階段就是before利多卡因跟after利多卡因 我們record了30秒 然後我只分析了後20秒 原因是因為前10秒有時候它的峰不是很穩定 就不想要有一些非真實的雜訊 所以我們就是等它穩定之後我們再做分析 就是分析了後20秒 你可以發現在加低多卡因之前 它的震盪 無論震盪頻率還是它的GCaMP的intensity 都是很高的 但之後就整個降低了 然後我們把它的mean (平均) 萃取出來 然後減掉 把全部的signal壓在0線上 你就可以看到說在 加利多卡因之前是很亂 那之後就很鎮定 接著我用R 做一個傅立葉轉換 把每一條線 每一個wave 分化成無限多個sine wave 那sine wave 每個sine wave都會帶有一個頻率 跟一個振幅 就可以畫頻率對振幅的圖 我們叫做periodogram 頻譜圖 這樣的話 我們就可以知道說 黑色是在加利多卡因之前 紅色是之後 你在這個線下面積越 大，代表說 這個細胞的spontaneous activity 或者它的自主性的震盪是越多的 你看黑色的話它是很高 它的area under the curve遠比紅色還要高 像我剛剛說的 我把紅色after lidocaine 我就減掉它減掉之後就得到這個藍色的curve 像這邊雖然只有一條線 但是它是有大概33條線所組成的 然後我這邊畫的是 是mean加上standard error of mean 讓大家看得比較清楚一點 但其實是我們每一個細胞都會是有一條線的 所以我們是把每一個 每一條線在線下面積 在0到2.5赫茲的線下面積 去記錄起來然後之後做圖 那之所以選0到2.5赫茲 像我剛剛講那個文獻 這個activity主要頻率是落在1赫兹 所以你有2.5赫兹 你絕對可以capture到你所有想capture的東西 那由於我們的 的影像的造影頻率是10赫兹 我是每100毫秒拍一幀 那這種建議會是說 你的frequency of interest 會建議是在你的 （不好意思講錯） 就是你的造影頻率會 建議是在你的Frequency of Interest的3到5倍 那像我的造影頻率是10赫茲 然後2.5赫茲大概是10赫茲的四分之一 那這樣的話你就可以 很好的把你所想要的東西都capture進去 那在巨噬細胞方面的話 我們有藉由一個protocol把人類的monocyte 單核細胞 在體外分化成MGC-like 就是我們在神經瘤裡面看到的細胞，跟M0是一種中性的巨噬細胞當作一個對照組 MGC-like的話它有帶有三種surface markers 我們用流氏細胞儀去定義這三種markers 去定量它們 然後可以發覺說，跟對照組的M0細胞比起來的話 這三種markers在MGC-like 表現的量是比較多的 然後接下來我們就是損傷神經之後 共培養MGC-like或M0四天 然後想要看說在Area Under the Curve 就是它的Spontaneous Activity的level是不是會增高 首先我們是先show一个Negative Control 就是當什麼都不培養的情況下 你切這個軸突跟不切 培養四天 然後去record這個soma這邊的spontaneous activity 它的AUC of the Periodogram是沒有差别的 那第二個control是我們不切 但是培養兩種不同的巨噬細胞 然後AUC也是沒有差別的 然後第三種是我們損傷之後 培養了MGC-like跟M0這種對照組的細胞 發現說MGC-like在Periodogram的AUC 是比M0還要高的 這可以解釋說 當我們創造一個就是體外損傷的環境 然後去共培養一種 就是我們在Morton’s Neuroma裡面所發現的巨噬細胞 四天之後我們可以看說 它跟正常的巨噬細胞是有顯著差異的 在這個spontaneous activity 這樣可以進而去解釋說 這種我們在這個神經損傷裡面看到的巨噬細胞 的確會對於 spontaneous activity會有所貢獻 spontaneous activity會有所貢獻 在疼痛的病人裡面 你一旦有這種的免疫細胞的話 你的神經可能就會比 其他正常的神經更活躍 我們就想要進而說明說 這種細胞它是 pathogenic 這是我們第一個實驗 然後就看到一個顯著差異，這是我們想要研究的領域跟方向 用這個圖做一個總結 就是我們有在莫頓神經瘤裡面 藉由sequencing跟染色 去看神經瘤裡面的免疫細胞的表徵 然後我們發現了一個MGGC type的Marcofage 然後我們目前是已經有用了live cell calcium imaging 去發現說當你損傷神經後的四天 你一旦跟這個MGC macrophage共培養的話 的確神經會比較活躍 相較於跟一般的macrophage共培養，我們下一步還會做的是 我們會把神經損傷之后 跟這個中性的macrophage M0共培養 可能4天到8天 然後用流式細胞儀方法 我有設計一個15個顏色的流式細胞儀的Panel 然後它可以去看說這個M0會不會 進而變成其他的macrophage subtype，可能變成MGC或其他的macrophage subtype 我們就可以去回答另外一個問題 就是受損的神經會不會對於免疫細胞的族群有所貢獻 然後我們下一步是會想要做single-cell RNA-seq 而不是單一個細胞 所以它的resolution比較低 那像做single-cell的話 我們就可能可以期望找出更多免疫細胞的markers 甚至說這些markers如果是共表達在同一個細胞上面的話，我們就可以以一個細胞為解析度去分析说 這些markers是不是有共表達在同一個細胞上 可以獲得更詳細的資訊 目前我們所在的進展是 我已經優化出一個protocol 是可以把免疫細胞从神經組織裡面萃取出来，然后藉由流式的染色 去分離出活的CD45 negative 非免疫細胞 以及CD45 positive免疫細胞 然後這兩個管我們就會之後送去做single-cell RNAseq 因爲在神經組織裡面不只有免疫细胞 還有其他的像fibroblast，Oligodendrocyte 所以我們想看說免疫細胞跟非免疫細胞 在這個莫頓神經瘤裡面 它們的populations跟它們的貢獻是怎麼樣 然後我們一旦有找到新的markers 我們就可以再送過去這個in vitro的co-culture platform 去做一個驗證 這是我們大概的research framework，也是近幾年會做的事情 目前除了這個莫頓神經瘤 我们還在收糖尿病患者 截肢患者的神經樣本 它也是一種蠻常見的 Neuropathic Pain和周邊神經損傷的一個症状 所以我們未來不只是這個疾病 我們還會擴展到另外的疾病 這是我所為今天想要做的分享 然後也希望大家有什麼feedback可以告訴我 然後也希望未來有可以合作的機會 謝謝大家