蛋白質的穩定性來自何處
你可能會想，天然蛋白質既然負擔這麽重要的生理功能，應該具有相當程度的穩定性。其實不然。据估算，在生理條件下，典型蛋白質的折疊和未折疊狀態的自由能差距大約只有20至65 kJ/mol。如果把這個自由能差距平均到每個氨基酸殘基，得到的數字將小到可以忽略不計。[1]對比中性水分子氫鍵的解離能約爲23 kJ/mol，水中蛋白質實際處於一種邊界穩定狀態。如果水分子氫鍵再强一些，就可能使一些蛋白質無法維持穩定構象。
氫鍵在蛋白質的高級結構中占有重要的地位。但整體上看，疏水作用通常是引導蛋白質構象變化的主導力量。通過對22種蛋白質（含有36 至 534 個殘基不等）的研究，如果只考慮疏水相互作用和氫鍵對蛋白質穩定性的貢獻，前者為60%，後者為40%。[2]因此，蛋白質的球狀構象主要是疏水相互作用的結果。這個因素對新生肽尤其重要：當肽鏈剛剛在核糖體生成時，具有非極性側鏈的氨基酸通常聚集在蛋白質的核心，在毫秒時間内摺叠成大致正確的構象。核心形成後，其它更弱的非鍵作用會進一步穩定蛋白質。
水含有廣泛的氫鍵網絡。其它分子的存在會引發水氫鍵的重組。對於疏水性分子，水分子會在其周圍形成一個高度有序的水化層，導致熵減。根據吉布斯自由能ΔG=ΔH-TΔS，熵減在能學上不利於水化過程。然而，如果非極性基團聚集在一起並遠離水分子的時候，水化層的範圍會減小，有序度也會降低，結果是水化熵增，即更有利於水化。因此，疏水性氨基酸側鏈傾向於聚集在蛋白質的內部，尤其是亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。這些氨基酸常見於蛋白質的疏水性核心。
那麽蛋白質表面的極性基團與水形成的氫鍵是否有助於其穩定性？可能有一些貢獻，但是很小。這是因爲純水每單位質量的氫鍵數高於絕大多數液體。即使是極性最強的非水分子也會使水中每單位質量的氫鍵數減少，何況大部分非水分子和水不能無限互溶。所以極性分子周圍也會在一定程度上形成水化層。這在一定程度上引起熵減。但是，其數值仍遠小於疏水性核心被掩蓋引起的熵增。最終的結果是後者獲勝。
靜電作用（鹽橋）的净效應也能在一定程度上穩定蛋白質。在蛋白質表面的親水區，鹽橋起到較小的穩定作用。但在非極性蛋白質內部情況如何？可能令人驚訝的是，疏水核心的靜電作用大大加强，提供的穩定能也加大。部分或完全埋藏的鹽橋可以為蛋白質結構提供顯著的穩定性。比如在嗜熱生物的蛋白質中，埋藏鹽橋的數量顯著增加，與其耐熱性的提高亦步亦趨。同時，不能生產鹽橋對的孤單離子（陰或陽）降低了蛋白質的穩定性。
最後，蛋白質大致摺叠為緻密構象後，范德華力開始展露頭角。這種力無處不在，其本質是偶極間相互作用，包括永久偶極子（比如極性鍵和離子鍵）以及瞬態偶極子（一個原子受到另一個永久或瞬態偶極子的極化誘發而產生的偶極子）。但是，范德華力又是一種對距離敏感（隨平方反比律減弱）且微小的作用力。它只能在幾個原子的距離發揮作用。當原子間距小於0.5nm時，范德華力表現爲其間的吸引力。在一個蛋白質動輒包含成千上萬個原子的情況下，其内部范德華力的合力不可小覷。
簡言之，蛋白質的穩定之道在於兩個原則。第一，疏水性殘基大部分埋藏在蛋白質內部，遠離極性環境。第二，蛋白質內氫鍵和鹽橋的數量最大化，盡量消除孤單（即不配對的）氫鍵和離子基團。但即使如此，在能學上，蛋白質仍處於邊界穩定狀態。有時小的環境擾動就可以使蛋白質的一級到四級結構土崩瓦解。這就是蛋白質的變性。
蛋白質的變性
幾乎所有人都有煎鷄蛋或者煮鷄蛋的經驗。蛋清本來是透明、粘稠的液體。在高熱下，它變成了白色、不透明的固體。這個過程就是蛋白質的變性（denaturation）。上文已經提到，蛋白質相當嬌貴。其結構在物理或化學因素作用下，高級結構被破壞從而導致性質改變和活性的喪失，成爲蛋白質的變性。變形分爲兩種。一種是可逆變性，另外一種是永久變性。可逆變性指在外界誘因消失後，蛋白質可以完全恢復其生理活性。永久變性導致了蛋白質空間構象的不可逆破壞，即使除去外界誘因也無法回復。
引起蛋白質變性的因素可分為物理和化學兩類。物理因素可以是加熱、加壓、脫水、攪拌、振盪、紫外線照射、超聲波的作用等；化學因素有強酸、強鹼、尿素、重金屬鹽、表面活性劑等。能引起蛋白質變性的條件是消毒及滅菌的基礎。醫藥工業和臨床上常用的手段包括高熱高壓（121 °C，約兩大氣壓）、化學處理（比如酒精浸泡手術器械、環氧乙烷消殺）以及輻射（比如紫外線、γ射綫等）。想要更長期保存蛋白質，也可以采用變性。煮熟、腌製、烟熏都是古代先民使用延長肉類保質期的辦法。另一方面，如果我們想保證蛋白質不變性（比如蛋白質藥物），就需要小心避免以上各種能使它們變性的條件。
通常蛋白質變性關心的是高級結構的解構，並不涉及一級結構的變化，比如蛋白質的水解。有時這兩種過程同時發生，無法拆分。比如濃鹽酸可以同時引發蛋白質變性和水解。變性蛋白質和天然蛋白質最明顯的區別是溶解度降低。這一點很容易理解。天然蛋白質有很多疏水氨基酸埋藏在核心中。變性後蛋白質的疏水氨基酸不再受到保護，而是直接暴露在極性的水環境中，溶解度自然低於變性前。
美國生化學家安芬森（Christian Boehmer Anfinsen，1916-95）是研究蛋白質變性的先驅。爲了證明蛋白質正確折疊的信息完全存在於蛋白質的氨基酸序列中，他用核糖核酸酶A（RNAse A）進行了一系列實驗。此酶有四個二硫鍵。當溶解在含有8 mol/L的尿素和少量2-巰基乙醇（HS-CH2-CHOH）的水中後，RNAse A徹底喪失活性。如果只除去尿素，該酶無法恢復活性；如果除去2-巰基乙醇，該酶可以恢復1%的活性；如果尿素和2-巰基乙醇皆去除，RNAse A可以恢復大部分活性。
分析發現，2-巰基乙醇打斷了所有的二硫鍵，尿素的功用則是干擾蛋白質氨基酸殘基之間的氫鍵。在二者的作用下，RNAse A的高級結構被摧毀，只剩下了一級結構。只除掉尿素，酶的二硫鍵無法恢復，所以沒有活性。除掉巰基乙醇後，該酶中存在的 8 個半胱氨酸之間隨機形成了二硫鍵，共有105種不同的組合。其中正確組合的几率為1/105，約1%。所以酶活性有些微恢復。外界干擾完全消失之後，RNAse A很快大部分恢復到正常構象，但仍然不是100%。這是因爲縂有一部分分子未能摺叠到正確構象。生命解決這個問題的辦法是蛋白質二硫鍵異構酶。這個酶的功能就是檢查其它酶的二硫鍵是否異常。發現不正確的二硫鍵，二硫鍵異構酶就會切斷該鍵，輔助正確二硫鍵的生成。
題圖：與AMP複合的Ustilago sphaerogena核糖核酸酶U2晶體結構（PDB文件名3AGN）。（來源：wikicommons，CC-BY-NA 4.0）
引用和注釋
[1] 人體中蛋白質含有的氨基酸殘基個數的中位數是375。假設因正確摺叠，該蛋白質獲得的自由能為65 kJ/mol，平均到每個氨基酸爲65/375=0.17 kJ/mol。這個數字遠低於kT，即在溫度T時的熱噪音水平。室溫時kT約爲2.5 kJ/mol。k是玻爾茲曼常數，T是絕對溫度。
[2] DOI: 10.1016/j.jmb.2011.02.053.
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